O processo de Fertilização In Vitro, ou seja, a concepção natural, ocorre após a penetração do espermatozóide através do óvulo no interior da trompa. O óvulo fertilizado (zigoto) vai, então, dividir-se e suas células se multiplicarão em: 2 células, 4, 8, mórula e blastocisto. Este é o estágio final do desenvolvimento embrionário, quando o embrião atinge o útero para implantar-se no endométrio (camada interna do útero).

O desenvolvimento do óvulo fertilizado até o estágio de blastocisto leva aproximadamente cinco dias e requer recursos laboratoriais especiais para ocorrer. Até alguns anos atrás, a transferência dos embriões para o útero se fazia dois ou no máximo três dias após a captação dos óvulos. Apesar de os embriões, no estágio de blastocistos, terem maior capacidade de implantação, os métodos de cultura para se obter blastocistos eram ineficientes e muito trabalhosos.

Então, foi formulado um novo sistema de cultura, mais simplificado, para o desenvolvimento de blastocistos, que alcançou taxas de gravidez surpreendentes. O aumento dessas taxas, por outro lado, permitiriam a transferência para o útero de um menor número de embriões com conseqüente diminuição da incidência de gestações múltiplas. A cultura de embriões até o estágio de blastocisto traz implicações clínicas muito importantes.

Uma delas é a melhor seleção de embriões viáveis, visto que embriões com capacidade de atingir o estágio de blastocisto e superar as condições impostas pela cultura no laboratório têm melhor desempenho e, portanto, melhores chances de implantação. Como os blastocistos são embriões com maior capacidade de implantação, é possível se reduzir o número de embriões transferidos sem diminuir as taxas de gravidez.

A biópsia do embrião no estágio de blastocisto permite a retirada de uma quantidade de células relativamente grande. O DNA (material genético) destes blastocistos pode ser analisado e várias mutações podem ser detectadas por técnicas de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase).

Apesar dos grandes avanços nas técnicas de Reprodução Assistida, principalmente após a melhora das taxas de fertilização com a microinjeção de espermatozóide (ICSI), as taxas de implantação continuavam inalteradas. Uma das possíveis causas seria a incapacidade dos blastocistos de aderirem ao endométrio e sofrerem o processo de hatching causada por condições de cultura inadequadas.

A técnica de Assisted Hatching consiste na abertura de um "buraco" na zona pelúcida (camada que envolve o embrião) durante o período de desenvolvimento in vitro com o intuito de se facilitar a saída das células do blastocisto através do embrião e sua aderência ao endométrio. É uma técnica que tem sido discutida e gerado controvérsias na literatura médica. Os trabalhos são discordantes e poucos deles têm sido prospectivos e randomizados a ponto de mostrar convincentemente sua utilidade.

O Assisted Hatching é realizado em geral no terceiro dia de cultura in vitro (quando o embrião possui aproximadamente oito células) através de várias técnicas:

  • Partial zone dissection (PZD): dissecção parcial da zona pelúcida através de uma micropipeta,
  • Zone drilling: abertura química da zona pelúcida pela digestão parcial da mesma com ácido Tyrode,
  • Zone thinning: adelgaçamento da zona pelúcida com ácido Tyrode ou com laser,
  • Abertura puntiforme da zona pelúcida com laser,
  • Abertura puntiforme e mecânica da zona com micromanipulador de Piezo,
  • Remoção total da zona pelúcida com ácido Tyrode.

A principal causa de perda embrionária em Reprodução Humana e em Fertilização In Vitro é a alta incidência de anormalidades cromossômicas que se originam de problemas de disjunção cromossômica no óvulo ou no embrião. Tais anormalidades têm maior incidência com o aumento da idade. Como identificar aneuploidias e outras mutações genéticas nos embriões humanos?

O diagnóstico genético pré-implantacional permite a análise genética dos embriões antes de sua transferência para a cavidade uterina. A técnica consiste na retirada com micropipeta de um ou mais blastômeros (célula do embrião), sem comprometimento do desenvolvimento do embrião. A constituição cromossômica destes blastômeros pode ser analisada por hibridização fluorescente (in situ FISH - Fluorescent In Situ Hybridization) ou por reação em cadeia de polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction). A identificação de aneuploidias (anormalidades genéticas) pode auxiliar na identificação dos embriões com melhor capacidade de implantação e de desenvolvimento normal.

O diagnóstico genético pré-implantacional auxilia também na identificação da mutações dominantes e recessivas que ocasionam doenças genéticas graves. A opção de se fazer o diagnóstico antes da transferência dos embriões para o útero dá ao casal com alto risco genético a possibilidade de não ter de enfrentar uma interrupção voluntária da gravidez, única escolha no diagnóstico genético pré-natal.

As estruturas biopsiadas para o diagnóstico genético no período de pré-implantação podem ser:
  • Corpúsculo polar: A biópsia do corpúsculo polar (estrutura que contém o material nuclear do embrião) não afeta a fertilização e a viabilidade dos embriões resultantes assim como seu desenvolvimento após a implantação. Verlinsky e Cols¹ analisaram diagnóstico genético através do corpúsculo polar em 700 ciclos de Fertilização Assistida para diagnóstico pré-implantacional para casos de fibrose cística, deficiência da a-1-antitripsina, retinite pigmentosa, hemofilia A e B, talassemia, Alport, Doença de Gaucher, Tay Sachs, anemia falciforme e anormalidades cromossômicas. Mais de 4.000 óvulos foram testados. Houve transferência embrionária em 75% dos ciclos resultando em uma taxa de gravidez de 23%. Mais de 90 crianças não afetadas nasceram, confirmando o resultado do diagnóstico da biópsia do corpúsculo polar.

  • Blastômeros de embriões de pelo menos 4 células: Após a Fertilização In Vitro os embriões podem ser biopsiados durante vários estágios de clivagem (fragmentação) e os blastômeros retirados, preparados para análise genética. No início da década de 90 o diagnóstico genético pré-implantacional era utilizado para casais com risco de ter crianças com doenças ligadas ao cromossomo X. Atualmente a hibridização Fluorescente In Situ com combinações de sondas para cromossomos autossômicos e sexuais é utilizada para diagnóstico de sexo. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é utilizada geralmente para diagnosticar defeitos gênicos específicos. A estatística mundial dos casos de diagnóstico genético pré- implantacional mostra taxas de gravidez de aproximadamente 26% por transferência embrionária².

  • Biópsia de blastocistos:
  • A biópsia de blastocistos está se tornando bem mais acessível devido aos avanços nos sistemas de cultura que permitem atingir mais facilmente o estágio de blastocisto 3.
    As vantagens são:
    a) alto grau de viabilidade devido à seleção natural dos embriões,
    b) biópsia realizada somente no trofodermo com mínima lesão da massa celular,
    c) número bem maior de células disponíveis para análise genética.
    As desvantagens são:
    a) dificuldade técnica de se retirar células que estão aderidas umas às outras,
    b) necessidade de se manter os embriões em cultura por mais 2 ou 3 dias. A experiência com biópsia de blastocistos ainda é inicial e não se dispõe de dados clínicos suficientes para se tirar conclusões consistentes.

    1. Verlinsky, Y.; Cieslak, J.; Ivakhnenko, V.; Lifchez, A.; Strom, C.; Kuliev, A. Birth of healthy children after preimplantation diagnosis of common aneuploidies by polar body FISH analysis. Fertil. Steril. 1996;66:126-9.

    2. Verlkinsky, Y.; Handyside, A.; Grifo, J.; Munne, S.; Cohen, J. et al. Preimplantation diagnosis of genetic and chromosomal disorders. J. Assist. Reprod. Gen. 1994;11(5): 236-43.

    3. Carson, S.A.; Gentry, W.L.; Smith, A.L.; Buster, J.E. Trophectoderm microbiopsy in murine blastocysts: comparison of four methods. Assist. Genet. 1993;10:427-33.

O avanço da Medicina Reprodutiva tem ocorrido paralelamente ao avanço da Genética Humana. Presença de deleções (alterações) de genes no cromossomo Y e mutações no gene do receptor androgênico (receptor para substâncias que promovem as características masculinas) têm sido relacionadas à infertilidade masculina. O conhecimento cada vez maior do genoma humano e as variações no DNA dos genes que controlam a maturação dos gametas, a fertilização, a implantação e o desenvolvimento fetal se tornarão determinantes importantes da probabilidade de fertilidade dos casais.

O mapeamento do cromossomo Y determinou regiões com deleção como a região AZFc que é a causa molecular mais comum da falência na espermatogênese (processo de produção de espermatozóides).*

*Reijo, R.; Alagappan, R.K.; Patrizio, P.; Page, D.C. Severe oligozoospermia resulting from deletions of azoospermia factor gene on Y chromosome. Lancet 1996;347:1290-3.

Oócitos recuperados de folículos não estimulados no ovário podem ser maturados in vitro, fertilizados e alguns podem desenvolver-se e serem transferidos para as pacientes.

A maturação in vitro de óvulos tem várias vantagens. A mais importante é a redução dos custos com um tratamento mais simples e menos invasivo.

Os sistemas para maturação de óvulos podem ser especialmente úteis, por exemplo, para pacientes com ovários policísticos. Tais pacientes têm freqüentemente um grande número de óvulos que podem ser obtidos de pequenos folículos, sem necessidade de tratamento com gonadotrofinas (hormônios) para estimular o crescimento folicular.

A utilização desta técnica com sucesso para tais pacientes pode permitir sua aplicação para outras pacientes que queiram evitar os efeitos indesejáveis das altas doses de drogas para hiperestimulação ovariana.

Até o momento houve um número muito pequeno de gestações relatadas para se tirar conclusões adequadas sobre a segurança da técnica.

Outro aspecto a ser salientado é a possibilidade de se associar esta técnica, combinada com a criopreservação de óvulos, permitindo sua utilização mais eficiente e contribuindo para o estabelecimento de um programa de doação e criação de um banco de óvulos.*

*Trounson, A.O.; Wood, C.; Kausche, A. In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polycystic ovarian patients. Fertil. Steril. 1994;62:353-62.

A transferência nuclear pode ser utilizada para corrigir doenças genéticas mitocondriais.* O núcleo de células de embriões em estágios iniciais de desenvolvimento podem ser isolados dos elementos mitocondriais do citoplasma e introduzidos em um citoplasma enucleado de um óvulo de uma doadora que tenha função mitocondrial normal.

Outra alternativa é a transferência de uma pequena porção do citoplasma do óvulo de uma doadora para o óvulo de uma receptora para a correção de anormalidades genéticas.

*Cohen, J.; Scott, R.; Schimmel, T.; Levron, J.; Willadsen, S. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs. Lancet 1997;350:186-7.

A criopreservação (congelamento) de óvulos pode oferecer soluções a uma série de problemas éticos, religiosos e legais relacionados ao congelamento de embriões. Com essa técnica é possível manter a fertilidade de mulheres que sofrem de patologias que podem comprometer a função ovariana como falência ovariana precoce, endometriose, cistos e infecções pélvicas. A criopreservação de óvulos pode também facilitar a logística dos programas de doação de óvulos.

Os protocolos de criopreservação de óvulos, porém, apresentam problemas técnicos que ocasionaram baixas taxas de sobrevivência após o descongelamento e baixo número de gestações. Uma das razões aventadas seria a possibilidade da indução de aneuploidias após a exposição aos crioprotetores e ao congelamento propriamente dito.

Pesquisas mais recentes têm mostrado, no entanto, cromossomos e cariótipos normais após o descongelamento. Com a utilização da técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) foram obtidas taxas de fertilização e implantação melhores.

Outro grande avanço em Medicina Reprodutiva é a opção de criopreservar tecido ovariano para mulheres com o objetivo de autotransplante, cultura de folículos primordiais ou o uso de técnicas de xeno-transplante para recuperar óvulos com capacidade de desenvolvimento. Essa técnica está particularmente indicada para pacientes jovens com câncer e que desejam preservar suas células germinativas para evitar o dano potencial causado pela radio ou quimioterapia.*

Estudos experimentais em animais demonstraram que após o congelamento, o descongelamento e o autotransplante de fragmentos da córtex ovariana, ciclos ovulatórios puderam ser restabelecidos assim como a fertilidade. Progressos no sentido de se maturar folículos de tecido congelado e descongelado para a fertilização in vitro, porém, ainda caminham lentamente.

*Newton, H.; Fisher, J.; Arnold, J.R.; Faddy, M.; Gosden, R.G. Permeation of human ovarian tissue with cryoprotective agents in preparation for cryopreservation. Hum. Reprod. 1998;13:376-80.

O nascimento da ovelha "Dolly" foi um dos eventos mais comentados nos últimos tempos. Foi a primeira demonstração do que podemos chamar de "equivalência nuclear" em células adultas de qualquer espécie, a prova de que os núcleos de células somáticas contém todo o material genético necessário para a produção de um animal viável através da transferência nuclear. Demonstrou também que diferentes fenótipos (em nível nuclear) podem ser revertidos.*

A tecnologia desenvolvida durante esses estudos tornou possível não somente a precisa modificação genética de várias espécies de animais mas também permitiu elucidar melhor o processo de diferenciação celular que pode levar a uma nova gama de possibilidades terapêuticas para doenças humanas.

A produção de animais de uma única célula torna possível sua modificação genética em cultura e as células modificadas podem ser selecionadas antes da produção do animal. A produção de animais com múltiplas modificações genéticas requer adição, remoção ou modificação seqüencial de genes.

A modificação genética de células em cultura pode proporcionar não somente o desenvolvimento da tecnologia transgênica mas também facilitar modificações genéticas antes improváveis. Animais transgênicos podem ter um papel fundamental em uma série de terapias para doenças humanas:

  • Produção de proteínas humanas em animais transgênicos. Proteínas humanas podem ser produzidas em vários tecidos e fluidos corporais como sangue, urina e leite. A grande vantagem da produção biofarmacêutica em animais transgênicos reside no fato do alto volume que pode ser produzido com baixo custo;
  • Modificação do leite animal para aumentar seu valor nutricional ou remover alérgenos;
  • Uso de órgãos e outros tecidos animais para transplante em humanos. Os órgãos do porco, por exemplo, são muito similares aos do homem e são considerados adequados para transplante. O maior problema, no entanto, é a rejeição. Apesar de nem todos os mecanismos envolvidos no processo de rejeição serem totalmente entendidos sabe-se que o antígeno envolvido mais freqüentemente é a a-1,3 galactose que está presente no porco mas não em humanos que, portanto, desencadeiam uma resposta imunológica. A transferência nuclear de células em cultura poderão facilitar a codificação gênica do porco para a a-1,3,galactosyl transferase eliminando os riscos de rejeição. Órgãos potenciais para transplante podem ser o coração, pulmões, rins, fígado e pâncreas;
  • A tecnologia de transferência nuclear pode também ser útil para produzir modelos de doenças em espécies que são mais fisiologicamente parecidas com os homens para o estudo da progressão de doenças e possíveis terapias.
*Newton, H.; Fisher, J.; Arnold, J.R.; Faddy, M.; Gosden, R.G. Permeation of human ovarian tissue with cryoprotective agents in preparation for cryopreservation. Hum. Reprod. 1998;13:376-80.

O desenvolvimento das técnicas de Reprodução Assistida representou um enorme avanço no tratamento dos casais inférteis. Tal tecnologia, porém, esbarra em importantes e fundamentais aspectos da vida desses casais e da sociedade. Como toda área do conhecimento humano onde o progresso científico anda mais rápido que a discussão na sociedade e a formulação de leis, a Reprodução Assistida envolve aspectos legais e éticos cuja reflexão e discussão são imprescindíveis.

Alguns pontos para reflexão:

  • Quem decide sobre o direito de se realizar tratamentos de Fertilização Assistida?
  • Quem decide quais casais devem ser tratados?
  • Quem decide sobre criopreservação, sobre o número de embriões congelados, sobre redução embrionária, sobre doação de gametas ou embriões?
  • Com o desenvolvimento das técnicas de diagnóstico genético pré- implantação surge a pergunta: até onde podemos ir?
  • Apesar das evidentes e diversas vantagens da clonagem de animais, o que dizer a respeito da clonagem de humanos?

Em conclusão, podemos dizer que o rápido desenvolvimento de novas técnicas e recursos em Reprodução Humana têm permitido ajudar inúmeros casais. É necessário e fundamental que tais técnicas sejam utilizadas com discernimento, baseadas em conclusões clínicas bem evidenciadas e embasadas em pesquisa científica séria e ética. A discussão da sociedade e dos órgãos competentes deve ser estimulada para que a comunidade científica seja norteada por diretrizes claras e éticas para o desenvolvimento dessa tecnologia.